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Biologische Kryo-TEM-Untersuchungen unterhalb von 3 Å?

Bei biologischen Kryo-TEM-Expe­rimenten spielt die erreichbare Auf­lö­sung eine sehr große Rolle. Lange Zeit war es unmöglich, Struk­turen zu untersuchen die kleiner waren als 3 Å. Der limitierende Faktor war die Auflösung der verwendeten TEM-Ka­meras, bei denen es sich um traditio­nelle Szintillator-gekoppelte CCD­­/CMOS-Kameras handelte. Ab­bil­dung 1 zeigt, welchen Einfluss die Ent­­wicklung der sogenannten Di­rect-Detection-Kameras für die biolo­gische Kryo-TEM-Forschung hatte.

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Abb. 1: Anzahl der in der EMDataBank (http://www.emdatabank.org/) gemeldeten Strukturen, gruppiert nach gemeldeter Auflösung.

Aufgezeigt ist die zeitliche Entwick­lung der Anzahl der veröffent­lichten Untersuchungen für biologi­sche Struk­­­turen hinsichtlich deren Auf­lö­sung für 2, 3 und 4 Å. Im Jahr 2011 gab es die erste Veröffentlichung, in der eine Direct-Detection-Kamera genutzt wurde. Bridget Carragher und Clint Potter vom The Scripps Research Institute verwendeten eine DE-12-Kamera von Direct Electron. In den darauffolgenden Jahren löste diese Art Kamera die traditionellen CCD-Kameras ab, was zu einem rapiden Anstieg an untersuchten Strukturen im 2-4 Å-Bereich führte. Seit 2014 ist es nun auch möglich, Strukturen unterhalb von 3 Å aufzunehmen. Eine Option, die lange Zeit als nicht möglich galt.

Mittlerweile hat sich aber herausgestellt, dass die Auflösung bei biologi­schen Kryo-TEM-Experimenten nicht mehr der alles entscheidende Fak­tor ist. Viel wichtiger ist es, die Güte der aufgenommenen Bilder zu verbessern und die Geschwindigkeit der Bildaufnahme zu erhöhen. Scott Stagg von der Florida State University benötigte so für die Aufnahme der in Abbildung 2 gezeigten Struktur (ca. 2,9 Å Auflösung) nur knapp drei Tage. Er verwendete dafür eine DE-20-Kamera von Direct Electron, die an ein Titan-Krios-TEM montiert wurde.

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Abb. 2: Kryo-EM-Modell und Messergebnis einer Variante eines AA-Virus (adeno-associated virus) mit einer Auflösung von ca. 2,9 Å. Die zugrunde liegenden Daten wurden in nur drei Tagen erfasst.

Direct Electron hat in den letzten Jahren die Entwicklung dieser Ka­meras vorangetrieben und bietet mit der DE-64 die derzeit beste Ka­mera für biologische Kryo-TEM-Expe­ri­mente an. DE-64 ist die einzige Direct-Detection-Kamera mit einem 8 k x 8 k-Sensor, was einem Bild­be­trach­tungsfeld von 67,1 Mega­pixeln entspricht.

Im Vergleich zu anderen Direct-Detection-Kam­eras, die über ein 4 k x 4 k-Sensorfeld verfügen, bie­tet sie folgende Vorteile:

  • Es werden weniger Bilder für Einzelpartikeluntersuchungen benö­tigt.
  • Auch große Objekte (z. B. Viren) können im Ganzen untersucht werden.
  • Die 3D-Rekonstruktion wird durch verfeinertes CTF-Fitting deutlich verbessert.
  • Eine hohe Bildrate sorgt für eine schnellere Bildaufnahme.

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Andreas Bergner
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