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Anwendungsnotiz: Analyse der Größenverteilung von Influenza-Viruspartikeln mit der CPS Scheibenzentrifuge

LOT-QuantumDesign

Influenzavirenproduktion für saisonale Grippeimpfungen

von Michael M. Pieler und Michael Wolff, Otto-von-Gue­ricke-Universi­tät, Mag­de­burg

Impfen ist eine wichtige Maßnahme, um den Ausbruch von Grippeviren unter Kontrolle zu bringen. Daher werden große Anstrengungen unternommen, Produktionsprozesse zu opt­i­mieren und neue Wege zur Her­stel­lung von Impfstoffen zu finden. Ein zunehmend wichtiger Faktor in neuen Produktionsprozessen ist die Aggregation von Viruspartikeln. Je nach angewendetem Verfahren während des Downstream Processing (DSP), z. B. (Crossflow-) Filtration, Chromatografie oder Zentrifugation, können die Verluste durch Parti­kel­aggregation enorm sein. Deshalb werden aktuell verschiedene Prozess­bedingungen untersucht, um ihren Einfluss auf die Viruspartikel-Aggre­gation zu bestimmen und Erkenntnisse über die dadurch entstehenden Effekte zu gewinnen.

Methode

Zuerst wurde die Größenverteilung der in MDCK-Zellen produzierten Grippevirenstämme (A/Puerto Rico­/8/34, A/Wisconsin/67/2005, A/Eq/New­market, und B/Malay­sia/2506/2004) bestimmt. 1,2,3 Anschließend wurden sie mittels differentieller zentrifugaler Sedimentation mit einer Schei­benzentrifuge Typ DC24000 UHR von CPS analysiert (Neumann et al.4). Die Messungen wurden bei 24000 rpm durchgeführt, mit ei­nem Saccharosegradienten zwischen 2 und 8% w/v in 1x Phosphat-gepuf­ferter Salzlösung (1x PBS). Der Gra­dient wurde für 30 min äquilibriert; pro Analyse wurden 200 µL der Probenflüssigkeit injiziert. Die Messzeit pro Probe betrug ca. 15 Mi­nuten.

In den Abbildungen sind die Pro­benwerte jeweils als Mittelwert aus drei Messungen an der gleichen Pro­be (technical replicate) in neuen Gra­dienten dargestellt.

Analyse mit der CPS Scheibenzentrifuge
Abb. 1
Analyse mit der CPS Scheibenzentrifuge
Abb. 2

Ergebnis und Diskussion

Alle getesteten Grippevirenstämme zeigten einen großen Peak im Grö­ßenbereich 80 – 90 nm. Für B/Ma­laysia/2506/2004 wurde ein weiterer breiter Peak bei ca. 280 nm beobachtet (Abb. 1). Außerdem wurden Peaks um 70 – 80 nm verzeichnet, was eventuell auf Zellrückstände oder Virenfragmente zurückgeführt werden kann. Die Größenverteilung einer 20fach konzentrierten A/Puer­­to Rico/8/34-Probe nach einer 1:3-Verdünnung in 10 mM Tris-HCl pH 7,4 und einer 0,45-µm-Filtration zeigten kaum Abweichungen im Ver­gleich zur ursprünglich konzentrierten Virenprobe (s. Abb. 2, blaue und grüne Linie).
Dennoch zeigte die Auswertung von aus dem Membranadsorber und der Partikel-basierenden Matrix eluierten Viruspartikeln mit äquivalenten Funktions­gruppen und ähnlichen Backbone-­Strukturen unterschiedliche Partikelgrößen­vertei­lun­gen. Die aus dem Membran­ad­sor­ber eluierten Virus­parti­keln zeigten einen scharfen Peak bei 85 nm, genau wie das geladene Material (s. Abb. 2, blaue Linie). Die aus der Partikel-basierenden Ma­trix eluierten Viruspartikeln zeig­ten dagegen einen breiten Peak von ca. 80 nm - 2 μm (s. Abb. 2, violette Linie, Größenangaben nur bis 400 nm).

Fazit

Kleinste Abweichungen in Prozessbe­dingungen können zu signifikan­ten Veränderungen in der Grö­ßen­verteilung von Viruspartikeln führen. Dies wiederum kann den Ertrag und die Rein­heit erheblich mindern. Eine erhöh­te Aufmerksamkeit hinsichtlich Virus­ag­gregation kann die Her­stellungs­prozesse von Impfstoffen positiv beeinflussen und deren Leis­tungs- und Widerstandsfähigkeit be­günsti­gen. Die CPS DC24000 UHR Scheiben­zentrifuge ist hierfür ein nützliches Werkzeug. Um jedoch ein um­fas­sendes Bild über vorliegende Virus­aggregation zu bekommen, ist eine Kombination unterschiedlicher Me­thoden unabdingbar.

Referenzen

  1. Genzel, Y., Behrendt, I., König, S., Sann, H. & Reichl, U. Metabolism of MDCK cells during cell growth and influenza virus production in large-scale microcarrier culture. Vaccine 22, 2202–2208 (2004).
  2. Genzel, Y., Dietzsch, C., Rapp, E., Schwarzer, J. & Reichl, U. MDCK and Vero cells for influenza virus vaccine production: a one-to-one comparison up to lab-scale bioreactor cultivation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 88, 461–475 (2010).
  3. Genzel, Y., Fischer, M. & Reichl, U. Serum-free influenza virus production avoiding washing steps and medium exchange in large-scale microcarrier culture. Vaccine 24, 3261–3272 (2006).
  4. Neumann, A. et al. New method for density determination of nanoparticles using a CPS disc centrifugeTM. Colloids Surf. B Biointerfaces 104, 27–31 (2013).

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